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食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗

作者: 發布于:2018-6-22 8:48:57 點擊量:

 前言

本標準代替 GB/T 4789.10-2008《食品衛生微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》和
GB/T 4789.37-2008《食品衛生微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌計數》。 
本標準與 GB/T 4789.10-2008 和 GB/T 4789.37-2008 相比,主要修改如下:
——修改了標準的中英文名稱; 
——修改了范圍; 
——規范了樣品制備過程;
——增加了計算公式中系數 1.1 的解釋; 
——修改了附錄 A 中胰酪胨大豆肉湯的名稱,規范為 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯; 
——增加了第二法金黃色葡萄球菌 Baird-Parker 平板計數和第三法金黃色葡萄球菌 MPN 計數。 本標準的附錄 A、附錄 B、附錄 C 是規范性附錄。 
本標準所代替標準的歷次版本發布情況為: 
——GB 4789.10-84、GB 4789.10-1994、GB/T 4789.10-2003、GB/T 4789.10-2008。 
——GB/T 4789.37-2008。

食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗
1 范圍 
本標準規定了食品中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的檢驗方法。
本標準第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗;第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數;第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色 葡萄球菌的計數。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
2.1 恒溫培養箱:36 ℃±1 ℃。 
2.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。 
2.3 恒溫水浴箱:37 ℃~65 ℃。
2.4 天平:感量 0.1 g。 
2.5 均質器。
2.6 振蕩器。
2.7 無菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
2.8 無菌錐形瓶:容量 100 mL、500 mL。 
2.9 無菌培養皿:直徑 90 mm。 
2.10 注射器:0.5 mL。 
2.11 pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙。 
3 培養基和試劑 
3.1 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯:見附錄 A 中 A.1。 
3.2 7.5 %氯化鈉肉湯:見附錄 A 中 A.2。 
3.3 血瓊脂平板:見附錄 A 中 A.3。 
3.4 Baird-Parker 瓊脂平板:見附錄 A 中 A.4。
3.5 腦心浸出液肉湯(BHI) :見附錄 A 中 A.5。 
3.6 兔血漿:見附錄 A 中 A.6。
3.7 稀釋液:磷酸鹽緩沖液:見附錄 A 中 A.7。 
3.8 營養瓊脂小斜面:見附錄 A 中 A.8。 
3.9 革蘭氏染色液:見附錄 A 中 A.9。 
3.10 無菌生理鹽水:見附錄 A 中 A.10。

第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗

4 檢驗程序 
金黃色葡萄球菌定性檢驗程序見圖1。

金黃色葡萄球菌檢驗程序

圖1 金黃色葡萄球菌檢驗程序 
5 操作步驟
5.1 樣品的處理
稱取 25 g 樣品至盛有 225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質杯內, 8000 r/min~10000 r/min 均質 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或 10 %氯化鈉胰酪胨 大豆肉湯的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打 1 min~2 min。若樣品為液態,吸取 25 mL 樣品至盛有 225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠 )中,振蕩混勻。
5.2 增菌和分離培養
5.2.1 將上述樣品勻液于 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。金黃色葡萄球菌在 7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生 長,污染嚴重時在 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內呈混濁生長。 
5.2.2 將上述培養物,分別劃線接種到 Baird-Parker 平板和血平板,血平板 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。 Baird-Parker 平板 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h 或 45 h~48 h。 
5.2.3 金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上,菌落直徑為 2 mm~3 mm,顏色呈灰色到黑色,邊緣為 淡色,周圍為一混濁帶,在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度,偶然會遇 到非脂肪溶解的類似菌落;但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌 落所產生的黑色較淡些,外觀可能粗糙并干燥。在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、 金黃色(有時為白色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固 酶試驗。
5.3 鑒定
5.3.1 染色鏡檢:金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌,排列呈葡萄球狀,無芽胞,無莢膜,直徑約為0.5m~1m。 
5.3.2 血漿凝固酶試驗:挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落 1 個或以上,分別接種到 5 mL BHI 和營養瓊脂小斜面,36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。 
取新鮮配置兔血漿 0.5 mL,放入小試管中,再加入 BHI 培養物 0.2 mL~0.3 mL,振蕩搖勻,置 36 ℃±1 ℃溫箱或水浴箱內,每半小時觀察一次,觀察 6 h,如呈現凝固(即將試管傾斜或倒置時,呈現凝 塊)或凝固體積大于原體積的一半,被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌 株的肉湯培養物作為對照。也可用商品化的試劑,按說明書操作,進行血漿凝固酶試驗。
結果如可疑,挑取營養瓊脂小斜面的菌落到 5 mL BHI,36 ℃±1 ℃培養 18 h~48 h,重復試驗。
5.4 葡萄球菌腸毒素的檢驗 
可疑食物中毒樣品或產生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定,應按附錄B檢測葡萄球菌腸毒素。
6 結果與報告 
6.1 結果判定:符合 5.2.3、5.3,可判定為金黃色葡萄球菌。
6.2 結果報告:在 25 g(mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。

第二法 金黃色葡萄球菌 Baird-Parker平板計數
7 檢驗程序 
金黃色葡萄球菌平板計數程序見圖2。
金黃色葡萄球菌平板計數

圖 2 金黃色葡萄球菌 Baird-Parker 平板法檢驗程序

8 操作步驟
8.1 樣品的稀釋
8.1.1 固體和半固體樣品:稱取25 g樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000 r/min~10000 r/min均質1 min~2 min,或置盛有225 mL稀釋液的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1 min~2 min,制成1:10的樣品勻液。
8.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶 內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成1:10的樣品勻液。
8.1.3 用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL,沿管壁緩慢注于盛有 9 mL 稀釋液的無 菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用 1 支 1 mL 無菌吸管反復吹打使 其混合均勻,制成 1:100 的樣品勻液。
8.1.4 按 8.1.3 操作程序,制備 10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用 1 次 1 mL 無菌吸管或吸頭。
8.2 樣品的接種 
根據對樣品污染狀況的估計,選擇 2 個~3 個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在 進行 10 倍遞增稀釋時,每個稀釋度分別吸取 1 mL 樣品勻液以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接種量分別加入三塊 Baird-Parker 平板,然后用無菌 L 棒涂布整個平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如 Baird-Parker 平板表面有水珠,可放在 25 ℃~50 ℃的培養箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
8.3 培養
8.3.1.1 在通常情況下,涂布后,將平板靜置 10 min,如樣液不易吸收,可將平板放在培養箱 36 ℃±1 ℃培養 1 h;等樣品勻液吸收后翻轉平皿,倒置于培養箱,36 ℃±1 ℃培養,45 h~48 h。
8.4 典型菌落計數和確認
8.4.1 金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上,菌落直徑為 2 mm~3 mm,顏色呈灰色到黑色,邊緣為 淡色,周圍為一混濁帶,在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度,偶然會遇 到非脂肪溶解的類似菌落;但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌 落所產生的黑色較淡些,外觀可能粗糙并干燥。
8.4.2 選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀釋度 3 個平板所有菌落數合計在 20 CFU~ 200 CFU 之間的平板,計數典型菌落數。如果:
a) 如果只有一個稀釋度平板的菌落數在20 CFU~200 CFU之間且有典型菌落,計數該稀釋度平板上的典型菌落;
b) 最低稀釋度平板的菌落數小于 20 CFU 且有典型菌落,計數該稀釋度平板上的典型菌落;
c) 某一稀釋度平板的菌落數大于 200 CFU 且有典型菌落,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,應計數該稀釋度平板上的典型菌落;
d) 某一稀釋度平板的菌落數大于 200 CFU 且有典型菌落,且下一稀釋度平板上有典型菌落,但其平板上的菌落數不在 20 CFU~200 CFU 之間,應計數該稀釋度平板上的典型菌落;
以上按公式(1)計算。
e) 2 個連續稀釋度的平板菌落數均在 20 CFU~200 CFU 之間,按公式(2)計算。
8.4.3 從典型菌落中任選 5 個菌落(小于 5 個全選),分別按 5.3.2 做血漿凝固酶試驗。

9 結果計算:
公式(1):T=AB /CD (1)
式中: 
T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數; 
A——某一稀釋度典型菌落的總數; 
B——某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數; 
C——某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數; 
d——稀釋因子。

公式(2): T=(A1B1/C1+A2B2/C2)/1.1d (2) 
式中:
T ——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數;
A1——第一稀釋度(低稀釋倍數)典型菌落的總數; 
A2——第二稀釋度(高稀釋倍數)典型菌落的總數; 
B1——第一稀釋度(低稀釋倍數)血漿凝固酶陽性的菌落數;
B2——第二稀釋度(高稀釋倍數)血漿凝固酶陽性的菌落數; 
C1——第一稀釋度(低稀釋倍數)用于血漿凝固酶試驗的菌落數; 
C2——第二稀釋度(高稀釋倍數)用于血漿凝固酶試驗的菌落數; 
1.1——計算系數;
d ——稀釋因子(第一稀釋度)。
10 結果與報告
根據Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數,按9中公式計算,報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌數,以CFU/g(mL)表示;如T值為0,則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。

第三法 金黃色葡萄球菌MPN計數
11 檢驗程序 
金黃色葡萄球菌MPN計數程序見圖3。

金黃色葡萄球菌MPN計數

圖3 金黃色葡萄球菌MPN法檢驗程序

12 操作步驟
12.1 樣品的稀釋 
按8.1進行。
12.2 接種和培養 
12.2.1 根據對樣品污染狀況的估計,選擇 3 個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進 行 10 倍遞增稀釋時,每個稀釋度分別吸取 1 mL 樣品勻液接種到 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯管,每個稀 釋度接種 3 管,將上述接種物于 36 ℃±1 ℃培養 45 h~48 h。
12.2.2 用接種環從有細菌生長的各管中,移取 1 環,分別接種 Baird-Parker 平板,36 ℃±1 ℃培養 45 h~48 h。
12.3 典型菌落確認 
12.3.1 見 8.4.1。 
12.3.2 從典型菌落中至少挑取 1 個菌落接種到 BHI 肉湯和營養瓊脂斜面,36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。進行血漿凝固酶試驗,見 5.3.2。
13 結果與報告 
計算血漿凝固酶試驗陽性菌落對應的管數,查 MPN 檢索表(見附錄 C),報告每 g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數,以 MPN/g(mL)表示。




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