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溶源性細菌的檢查與鑒定

作者: 發布于:2017-12-5 10:43:57 點擊量:

 原理

細菌染色體上整合有前噬菌體(或稱原噬菌體)并能正常生長繁殖而不被裂解的細
菌,稱為溶源性細菌。溶源性細菌在自然界中普遍存在,而且自發裂解,釋放溫和噬菌
體,但頻率較低(10-2~105)物理方法(如紫外線和高溫)和化學方法(如絲裂霉素C)可誘導大部分溶源菌裂解并釋放溫和噬菌體。溶源性細菌對同一種或關系密切的噬菌
體具有免疫性,因此對于溶源菌的檢查必須有相應的敏感菌株才能確定,敏感菌株對以從待檢的溶源菌株相近的種或變種或不同菌株中找到。

溶源性細菌裂解釋放噬菌體,會給發酵工業帶來威脅,溶源性細菌使宿主細胞發生溶源轉變,不僅可以保護溶源菌免受同源噬菌體的再感染,還會賦予宿主細胞新的特性,溫和噬菌體已被廣泛用于轉導、基因工程載體和分子生物學等領域。本實驗采用誘導方法使溶源細菌裂解.再用敏感菌雙層平板法檢測誘導后噬菌體釋放數目的增加,從而確認細菌的溶源性。

材料

1.樣品 待檢菌——大腸桿菌225 (λ),敏感菌——大腸桿菌226。
2.培養基及藥品和試劑 LB固體、半固體和液體培養基,1%蛋白胨,100mmol/l Tris-HCL(pH7.6)緩沖液或生理鹽水,氯仿,0.2%檸檬酸鈉溶液。
3、設備 水浴箱、臺式離心機、紫外光燈、搖床等。
4、器皿及其他 試管、培養皿、三角瓶、吸管,離心管、濾膜、濾膜濾菌器等。

方法與步驟

本實驗采用紫外線處理誘導溶源菌裂解,未經誘導處理的溶源菌菌懸液做對照。
1.溶源菌培養 將經LB斜面活化的大腸桿菌225(λ),接種于裝有20mlLB培養液的250ml三角瓶內,30℃振蕩培養16h,再從中取2ml菌懸液接入另裝有20ml LB培養液的250ml三角瓶內,37℃振蕩培養2h至對數期。

2.排除游離噬菌體 如待檢菌株為芽孢桿菌,可先制成孢子懸液,再經80℃ 10min處理,殺死溶源菌表面可能吸附的及游        離的噬菌體;如待檢菌抹為非芽孢桿菌,可利用噬菌體制備的抗血清或0.2%檸檬酸鈉溶液洗滌對數期溶源菌細胞,除去表面吸附的及游離的噬菌體。然后經4000r/min離心10min,上清液可加人敏感指示菌做雙層平板測定,用于檢驗樣品屮足孖釕游離的噬菌體及吸附「溶源菌表曲的噬菌體,離心后的菌體細胞進行誘導處理。

 

3.誘導溶源菌 離心后收集的菌體用無菌生理鹽水洗滌兩次,用生理鹽水或100mmol/l Tris-HCL緩沖液(pH7.0)制成終濃度為1011個/ml細胞的菌懸液,每皿加5ml菌懸液,經紫外燈30W,距離30cm、照射30s,立即加入5ml雙倍濃度的LB培養液,混勻后37℃黑暗中培養2h。

4,溶源性菌株檢查 按雙層瓊脂法操作,取上述誘導裂解液加入幾滴氯仿,以10倍稀釋法適當稀釋,選擇后3個稀釋度的稀釋液,毎個稀釋液取0.3ml與0.2ml對數期敏感大腸桿菌226菌懸液混勻,再加入融化后冷卻至45℃的LB半體培養基,立即混勻,隨即傾入LB固體培養基平板上,待凝固后,37℃培養6h觀察。經過培養的平板如果有大量噬菌斑出現就證明被檢菌株是溶源菌。




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